細(xì)胞培養(yǎng)作為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的基本技術(shù)方法和一些生物制品的生產(chǎn)手段，其技術(shù)手段也得到了不斷發(fā)展。
傳統(tǒng)的二維(2D)細(xì)胞培養(yǎng)因其經(jīng)濟(jì)、便利、容易操作等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，在生物醫(yī)學(xué)等各領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。然而，二維培養(yǎng)的缺陷是細(xì)胞生存的環(huán)境與自然狀態(tài)下體內(nèi)三維環(huán)境的差異巨大，導(dǎo)致其形態(tài)、生理功能、藥物反應(yīng)等條件的改變。
向3D培養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變
為了解決這些問(wèn)題，近20多年來(lái)科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了許多三維(3D)細(xì)胞培養(yǎng)模型來(lái)滿足不同的應(yīng)用。三維細(xì)胞培養(yǎng)(Three-Dimensional Cell Culture)即將細(xì)胞培養(yǎng)于具有三維結(jié)構(gòu)的載體,使細(xì)胞在載體的三維空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長(zhǎng)，形成細(xì)胞-載體三維復(fù)合物，以利于更好地模擬體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境。3D細(xì)胞培養(yǎng)可分為支架三維培養(yǎng)(scaffold-based)和無(wú)支架三維細(xì)胞培養(yǎng)(scaffold-free)兩種方式。
體外3D細(xì)胞培養(yǎng)最關(guān)鍵的特征是，能夠最大程度為細(xì)胞提供合適的生長(zhǎng)微環(huán)境，并在體外創(chuàng)造組織樣結(jié)構(gòu)的能力，模擬體內(nèi)特定的細(xì)胞行為。越來(lái)越多的證據(jù)表明，3D細(xì)胞培養(yǎng)可以建立起生理上的細(xì)胞-細(xì)胞與細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，從而可以模擬天然組織的特異性，其生理相關(guān)性顯著強(qiáng)于傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)。有學(xué)者認(rèn)為，3D細(xì)胞培養(yǎng)顯著優(yōu)于2D培養(yǎng)方式，3D細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)新藥物開(kāi)發(fā)、疾病模型建立、干細(xì)胞應(yīng)用以及器官移植等方面可能會(huì)徹底改變?cè)蟹绞健?/p>
灌流培養(yǎng)的應(yīng)用
為了維持最佳的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，借鑒在大型化生物工程產(chǎn)業(yè)中提高蛋白質(zhì)等代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量而發(fā)展起來(lái)的灌流培養(yǎng)(perfusion culture)方式，開(kāi)始應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究中。通過(guò)灌流培養(yǎng)，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，不斷地將部分培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基，可為細(xì)胞提供更好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期培養(yǎng)，維持細(xì)胞與組織功能，并為進(jìn)一步分化等生長(zhǎng)提供良好條件。
實(shí)際情況下，許多細(xì)胞都暴露于由生物流體系統(tǒng)所產(chǎn)生的流體剪切應(yīng)力中，這些機(jī)械力對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、形態(tài)具有重要影響。因此，動(dòng)態(tài)灌流培養(yǎng)模式還可通過(guò)調(diào)節(jié)流速，模擬類似于體內(nèi)的流體剪切力環(huán)境，對(duì)于細(xì)胞的培養(yǎng)和研究也更加全面和具體。如內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)，適當(dāng)?shù)募羟辛τ欣诖龠M(jìn)其規(guī)范化的排布；干細(xì)胞培養(yǎng)則需要低剪切力環(huán)境避免刺激其分化。
另一方面，目前3D細(xì)胞培養(yǎng)還面臨克服營(yíng)養(yǎng)供給的難題。靜態(tài)培養(yǎng)下培養(yǎng)液的組織滲透深度有限，約200μm以內(nèi)。因此僅把具有3D結(jié)構(gòu)的類組織體浸沒(méi)于培養(yǎng)液中靜態(tài)維持，沒(méi)有流動(dòng)的血液和血流的通道或液流的動(dòng)力，類組織體結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞仍然難以獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)，難以實(shí)現(xiàn)在體外較長(zhǎng)時(shí)間的維持。動(dòng)態(tài)灌流培養(yǎng)方式，不僅能實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足、均勻的滲透，還可避免3D打印結(jié)構(gòu)體在靜態(tài)培養(yǎng)條件下從外向內(nèi)容易出現(xiàn)梯度效應(yīng)所形成的培養(yǎng)條件不均的現(xiàn)象。
CASE01
3D打印膠原PCL支架軟骨再生靜態(tài)培養(yǎng)與灌流培養(yǎng)評(píng)價(jià)
該項(xiàng)研究中，采用兩種不同的分化培養(yǎng)基（StemPro、TGF-β2），分別在凝膠化和非凝膠化PCL支架，靜態(tài)和灌流生物反應(yīng)器動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下，進(jìn)行軟骨分化實(shí)驗(yàn)比較。結(jié)果顯示，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)結(jié)合TGF-β2培養(yǎng)基有利于軟骨形成。
靜態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)良好，但在支架內(nèi)的滲透性有限，因此不能完全滿足三維培養(yǎng)的目的，相比之下動(dòng)態(tài)培養(yǎng)能使細(xì)胞在支架內(nèi)更好地滲透和均勻分布。在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中，非凝膠支架與內(nèi)部TGF-β2培養(yǎng)基相結(jié)合，增強(qiáng)了軟骨分化性能。
Konstantinos Theodoridis, Aristeidis Kritis, et al. Assessment of cartilage regeneration on 3D collagen-polycaprolactone scaffolds: Evaluation of growth media in static and in perfusion bioreactor dynamic culture[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2019.
(https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2019.110403)
CASE02
去細(xì)胞化肝支架灌流培養(yǎng)構(gòu)建竇狀微血管
去細(xì)胞化肝移植支架血管網(wǎng)生成是阻礙可移植肝移植發(fā)展的主要障礙。在該研究中，研究人員假設(shè)機(jī)械因素（如流體剪切應(yīng)力）和化學(xué)因素（如纖維連接蛋白涂層）都能促進(jìn)包括竇狀微血管在內(nèi)的分層血管網(wǎng)絡(luò)的形成，分別采用靜態(tài)培養(yǎng)、不同流速的灌流培養(yǎng)、經(jīng)50μg/ml纖維連接蛋白浸泡處理的灌流培養(yǎng)三種培養(yǎng)方式比較血管生成情況。
結(jié)果表明，灌流培養(yǎng)促進(jìn)了肝支架內(nèi)竇狀微血管的形成，而靜態(tài)培養(yǎng)則沒(méi)有觀察到。尤其是4.7?ml/min的灌流培養(yǎng)效果相對(duì)比2.4?ml/min和9.4?ml/min的灌流培養(yǎng)更為理想。在灌流培養(yǎng)中觀察到排列良好的內(nèi)皮細(xì)胞，這表明內(nèi)皮細(xì)胞感受到了流動(dòng)誘導(dǎo)的剪切應(yīng)力。此外，纖維連接蛋白涂層在4.7?ml/min的灌流培養(yǎng)中也促進(jìn)了竇狀微血管的形成。這項(xiàng)研究不僅為肝移植進(jìn)展也為藥物篩選和疾病模型研究提供了一定的指導(dǎo)意義。
Masafumi Watanabe, Ryo Sudo, et al. Construction of sinusoid-scale microvessels in perfusion culture of a decellularized liver[J]. Acta Biomaterialia, 2019.
(https://doi.org/10.1016/j.actbio.2018.12.042)
實(shí)驗(yàn)室3D動(dòng)態(tài)灌流培養(yǎng)解決方案
3D動(dòng)態(tài)灌流培養(yǎng)系統(tǒng)
現(xiàn)有的三維灌流培養(yǎng)裝置大多都是較大型的生物反應(yīng)器，而且需要專業(yè)的技術(shù)和特殊的培養(yǎng)載體，對(duì)實(shí)驗(yàn)研究和初步開(kāi)發(fā)就不完全適用。同時(shí)隨著生物3D打印等技術(shù)應(yīng)用的興起，科研工作中對(duì)個(gè)性化小型動(dòng)態(tài)灌流培養(yǎng)系統(tǒng)的需求逐漸突顯。
為更好的服務(wù)研究工作深層次開(kāi)展，邁普醫(yī)學(xué)自主研發(fā)推出適用于實(shí)驗(yàn)室的小型化3D動(dòng)態(tài)灌流培養(yǎng)系統(tǒng)。設(shè)備主要由儲(chǔ)液部(瓶)、動(dòng)力源，以及灌流槽三部分構(gòu)成。培養(yǎng)開(kāi)啟時(shí)，培養(yǎng)液循環(huán)流入灌流槽內(nèi)，形成閉環(huán)的循環(huán)回路，為細(xì)胞培養(yǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)及時(shí)帶走細(xì)胞代謝廢物，解決靜態(tài)培養(yǎng)代謝廢物排除、營(yíng)養(yǎng)滲透不均的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)體外生物制造類組織結(jié)構(gòu)體的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)，并維持較高的細(xì)胞活性。
此3D動(dòng)態(tài)灌流培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單小巧，可置于普通二氧化碳培養(yǎng)箱中使用；灌流培養(yǎng)流速、流量、壓力等可調(diào)節(jié)，形成不同流體剪切應(yīng)力環(huán)境適應(yīng)不同類型細(xì)胞培養(yǎng)；支持并聯(lián)或串聯(lián)多個(gè)灌流槽，進(jìn)行連續(xù)、長(zhǎng)期的動(dòng)態(tài)循環(huán)灌流培養(yǎng)，培養(yǎng)情況可即時(shí)通過(guò)顯微鏡觀察。設(shè)備適用于幾乎任何類型細(xì)胞的3D培養(yǎng)包括原代細(xì)胞、細(xì)胞系、干細(xì)胞及多種細(xì)胞共培養(yǎng)，可廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)、腫瘤、細(xì)胞學(xué)以及藥物研發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域的各實(shí)驗(yàn)室研究項(xiàng)目中。
- Joseph, J. S., et al. Two-dimensional(2D) and three-dimensional(3D) cell culturing in drug discovery[M]. Cell Culture: IntechOpen, 2018.
- Caleb Jensen, and Yong Teng. Is It Time to Start Transitioning From 2D to 3D Cell Culture?[J]. Frontiers in Molecular Biosciences, 2020.
- Bhaskar Birru, et al. Mechanistic role of perfusion culture on bone regeneration[J]. Journal of Biosciences, 2019.